Две одинаковые одноцепочечные молекулы рнк содержит вирус оспы
Экспрессия и репликация вирусного генома
Требования и ограничения
В ходе эволюции вирусов сложилось несколько стратегий, обеспечивающих: а) организацию вирусных генов и их кодирующую функцию, б) экспрессию вирусных генов, в) репликацию вирусных геномов и г) сборку и созревание вирусного потомства.
Прежде чем мы рассмотрим каждое из этих положений в деталях, стоит напомнить, что ключевым моментом в репликации вирусов является использование для синтеза вирусных белков хозяйских структур, синтезирующих белки клетки. Независимо от размеров, состава и организации своего генома вирус должен предоставить белоксинтезирующему аппарату эукариоти-ческой клетки информационную РНК, которую клетка должна распознать и транслировать. В этом отношении клетка навязывает вирусу два ограничения.
Во-первых, клетка синтезирует в ядре свою собственную мРНК путем транскрипции своей ДНК и последующего постранскрипционного процессинга транскрипта. Поэтому в клетке: а) ни в ядре, ни в цитоплазме нет фер* ментов, необходимых для транскрипции мРНК с вирусного РНК-генома, и б) в цитоплазме нет ферментов, способных транскрибировать вирусную ДНК. В связи с этим клеточную транскриптазу для синтеза вирусных мРНК могут использовать только вирусы, содержащие ДНК и способные проникать в ядро. Все другие вирусы вынуждены создавать собственные ферменты для синтеза мРНК.
Второе ограничение состоит в том, что синтезирующий аппарат эукариотических клеток приспособлен только для трансляции моноцистронных мРНК, так как он не распознает внутренних участков инициации в мРНК. В результате вирусы вынуждены синтезировать либо отдельные мРНК для каждого гена (функционально моноцистронная мРНК), либо мРНК, включающую несколько генов и кодирующую большой «полипротеин», который затем разрезается на индивидуальные белки.
Вирусные гены кодированы либо в РНК, либо в ДНК, которые могут быть либо одно-, либо двухцепочечными. Кроме того, геномы могут быть либо монолитными, когда все гены вируса содержатся в одной хромосоме, либо состоять из раздельных блоков, которые все вместе и составляют геном вируса. Во избежание ошибок мы обозначаем как «геномную» только нуклеиновую кислоту, которая заключена в вирионах.
Для удобства сначала лучше обсудить РНК-содержащие вирусы, фокусируя внимание прежде всего на функции геномной РНК.
Вирусы с одноцепочечной РНК можно подразделить на три группы. В первую группу входят пикорнавирусы и тогавирусы. Их геномы выполняют две функции (рис. 5.2 и 5.3). Во-первых, они функционируют как мРНК. Вирусы, геном которых может служить в качестве мРНК, принято называть вирусами с позитивным геномом. РНК пикорнавирусов после проникновения в клетку связывается с рибосомами и полностью транслируется. Затем продукт этой трансляции — полипротеин — расщепляется. Во-вторых, геномные РНК выполняют функцию матрицы для синтеза на ней комплементарных минус-цепей при участии полимеразы, появившейся в результате расщепления полипротеина. Образуется двуспиральная репликативная форма. На ее минус-цепях синтезируются новые плюс-цепи, которые могут использоваться в качестве а) мРНК, б) матриц для синтеза новых минус-цепей и в) составной части вирусных частиц потомства.
Размножение пикорнавирусов.
Тогавирусы и ряд других вирусов с позитивным геномом отличаются от пикорнавирусов в одном отношении: для трансляции в первом цикле синтеза белков доступна только часть их геномной РНК. Вероятной функцией образующихся при этом белков является способность транскрибировать геномную РНК. Они осуществляют синтез минус-цепи, которая в свою очередь служит матрицей для синтеза двух различных по размеру классов молекул плюс-РНК. В клетках, зараженных тогавирусами, РНК первого класса представлены небольшими молекулами мРНК, фланкирующими участок геномной РНК, который не транслировался в первом цикле. Образующиеся на них полипротеины расщепляются на белки, которые играют структурную роль в вирионах. Плюс-РНК второго класса состоит из полноразмерных цепей, которые упаковываются в вирионы.
Размножение тогавирусов.
Главным в репликации вирусов с позитивным геномом является способность геномной РНК служить в качестве мРНК после заражения. Это имеет двоякие последствия. Во-первых, ферменты, ответственные за репликацию генома, синтезируются после заражения, и нет необходимости в их внесении в зараженную клетку вместе с вирионом. Вот почему «голая» РНК, экстрагированная из вирионов, инфекционна. Во-вторых, так как все позитивные геномы относятся к монолитным и все их гены сосредоточены в одной хромосоме, первичный продукт трансляции обеих РНК (как геномной, так и мРНК) обязательно представляет собой единый белок. Продукты трансляции пикорнавиру-сов и тогавирусов должны быть затем расщеплены на индивидуальные белки, которые и обнаруживаются в вирионе или в зараженной клетке.
РНК-содержащие вирусы с негативным геномом: ортомиксовирусы, парамиксовирусы, буньявирусы, аренавирусы и рабдовирусы.
Их геномная РНК выполняет две матричные функции: во-первых, для транскрипции и, во-вторых, для репликации. В связи с тем что для синтеза мРНК должен транскрибироваться вирусный геном, а в клетках соответствующие ферменты отсутствуют, все вирусы с негативным геномом содержат в вирионе кроме вирусного генома транскриптазу. Транскрипция вирусного генома — первое событие после проникновения вируса в клетку, в результате которого накапливаются функционально активные моноцистронные мРНК [позитивные, или плюс-цепи], кодирующие один белок. Репликацию начинают новосинтезированные вирусные белки, катализирующие образование полной плюс-цепи, которая служит матрицей для синтеза геномной минус-РНК (рис. 5.4).
Главное в репликации вирусов с негативным геномом заключается в том, что геномная РНК функционирует как матрица и для транскрипции, и для репликации. Отсюда следует, что, во-первых, вирус должен внести с собой в зараженную клетку транскриптазу; во-вторых, «голая» РНК, экстрагированная из вирионов, неинфекционна; в-третьих, синтезируемые мРНК имеют длину одного гена, они кодируют один белок — единичный полипептид. Присутствие сигналов сплайсинга в определенных участках может обеспечить формирование нескольких мРНК (каждая из которых кодирует особый белок) с одного и того же участка генома. Следовательно, плюс-транскрипт, функционирующий в качестве мРНК, отличается от плюс-РНК, служащей матрицей для вирусного потомства, хотя и первый, и вторая синтезируются на геномной РНК. Кроме РНК-транскриптазы в репликации вирусной РНК участвуют вирусиндуцированнные: репликаза 1 (обрзование репликативной формы) и репликаза 2 (синтез вирионных -нитей).
Размножение ортомиксовирусов и парамиксовирусов.
Ортомиксовирусы (вирусы гриппа А; В;С) генм представлен не одной а набором односпиральных РНК (грипп птиц и человека 8-7фрагментов). В структуре вириона:
– РНК зависимая РНК полимераза (синтез +нитей,
– две разновидности РНК полимераз
РНК транскриптаза (синтез +нитей в начале инфекции,
РНК репликаза ( – нитей в конце инфекции)
Ретровирусы входят в третью группу РНК-содержащих вируссов.
Характерно, что геномы ретровирусов монолитны, но имеют диплоидную структуру, и обе цепи либо частично соединены водородными связями друг с другом, либо спарены неизвестным до настоящего времени образом. Единственная известная функция геномной РНК — матричная функция для синтеза вирусной ДНК. Поскольку эукариотические клетки не имеют для этого соответствующих ферментов, вирион кроме генома содержит еще и РНК-зависимую ДНК-полимеразу (обратную транскриптазу 1), а также смесь тРНК хозяина, одна из которых служит в качестве затравки. В цикле репродукции можно выделить следующие ключевые ступени: а) связывание комплекса тРНК —обратная транскриптаза с геномной РНК; б) синтез ДНК-копии, комплементарной по отношению к РНК, с переходом полимеразы с одной молекулы РНК-матрицы на другую, что приводит к образованию кольцевой одноцепочечной молекулы ДНК, связанной водородными связями с линейной геномной РНК; в) расщепление геномной РНК нуклеазой, атакующей только РНК в ДНК—РНК-гибридах (рибонуклеазои Н, также содержащейся в вирионе), и г) синтез комплементарной копии вирусной ДНК. Затем кольцевая двухцепочечная ДНК перемещается в ядро, где интегрирует с геномом хозяина, но последующая экспрессия вирусных генов не обязательна. Если экспрессия происходит, то интегрированная.вирусная ДНК транскрибируется транскриптазой клетки-хозяина. Продуктами транскрипции являются молекулы РНК, как равные по длине молекуле генома, так и более короткие мРНК-транскрипты нескольких соседних генов, которые транслируются с образованием полипротеинов. Полипротеины затем расщепляются на отдельные вирусные белки. В состав вирионов включаются только транскрипты, содержащие весь геном.
Размножение ретровирусов.
Источник
Биология
Учебник для 10-11 классов
Вирусы — это неклеточные формы жизни. Они являются облигатными (обязательными) внутриклеточными паразитами, т. е. вирусы могут функционировать, только попав внутрь бактериальной или эукариотической клетки.
Первооткрыватель вирусов Д. И. Ивановский еще в 1892 г. выявил два их основных свойства — они столь малы, что проходят через фильтры, задерживающие бактерии, и их невозможно, в отличие от клеток, выращивать на искусственных питательных средах. Вирусы (их размеры от 20 до 300 нм) удалось увидеть лишь с помощью электронного микроскопа в 30-х годах XX в.
ДМИТРИЙ ИОСИФОВИЧ ИВАНОВСКИЙ (1863—1920) — отечественный ученый. Открыл проходящий через фильтр (в отличие от бактерий) возбудитель болезни табака (табачной мозаики). Это был первый из описанных вирусов.
По остроумному определению Нобелевского лауреата П. Медавара вирусы — «это плохие новости в упаковке из белка». В значительной степени это действительно так: ведь попавшие в клетку вирусные гены — «плохие новости» — приводят к нарушению нормальных процессов в клетке, в ряде случаев к ее гибели, а также к заболеванию всего организма. Недаром свое название вирусы получили от латинского слова «вирус» — яд.
Ни один из известных вирусов не способен к самостоятельному существованию. Лишь попав в клетку, генетический материал вируса воспроизводится, переключая работу клеточных биохимических конвейеров на производство вирусных белков: как ферментов, необходимых для репликации вирусного генома — всей совокупности его генов, так и белков оболочки вируса. В клетке же происходит и сборка из нуклеиновых кислот и белков многочисленных потомков одного попавшего в нее вируса.
Отдельные вирусные частицы — вирионы представляют собой симметричные тела, состоящие из повторяющихся элементов. Внутри каждого вириона находится генетический материал, представленный молекулами ДНК или РНК. Есть вирусы, содержащие одну молекулу двухцепочечной ДНК в кольцевой или линейной форме; вирусы с одноцепочечной кольцевой ДНК; одноцепочечной или двухцепочечной РНК; содержащие две идентичные одноцепочечные РНК.
Генетический материал вируса окружен капсидом — белковой оболочкой, защищающей его как от действия нуклеаз — ферментов, разрушающих нуклеиновые кислоты, так и от воздействия ультрафиолетового излучения. Кроме того, капсид обеспечивает прикрепление вируса к поверхности клеточной мембраны, так как содержит молекулы, с которыми взаимодействуют рецепторы мембран клетки. Капсиды состоят из многократно повторенных полипептидных цепей одного или нескольких типов белков.
Большинство вирионов имеет форму палочек или правильных многогранников. У вирионов в форме палочек в центре находится спирально закрученная нуклеиновая кислота. Капсид состоит из идентичных субъединиц белка, расположенных вдоль молекулы нуклеиновой кислоты. Такое строение имеет большинство вирусов, поражающих растения, и некоторые вирусы бактерий, так называемые бактериофаги или просто фаги. Так, например, первый из описанных вирусов, вирус табачной мозаики (ВТМ), содержит спиральную молекулу РНК, заключенную в белковый капсид, состоящий из 2130 идентичных полипептидных субъединиц (рис. 26).
Рис. 26. Вирус табачной мозаики.
Слева — электронно-микроскопическая фотография, справа — модель, на которой показана спиральная укладка белковых субъединиц воеруг молекулы РНК
У большей части вирусов, вызывающих болезни человека и животных, капсид почти всегда имеет форму икосаэдра — правильного двадцатигранника с двенадцатью вершинами и гранями из равносторонних треугольников.
Существуют вирусы и с более сложным строением. Некоторые фаги, помимо икосаэдрической головки, содержащей генетический материал, имеют полый цилиндрический отросток, окруженный чехлом из сократительных белков и заканчивающийся площадкой с шестью короткими выростами и шестью длинными фибриллами — нитями (рис. 27). Такая сложная конструкция обеспечивает впрыскивание генетического материала внутрь бактериальной клетки.
Рис. 27. Схематическое изображение фага
Многие вирусы, помимо белкового капсида, имеют еще и внешнюю оболочку. Кроме вирусных белков и гликопротеинов (белков, связанных с углеводами), она содержит еще и липиды, позаимствованные из плазматической мембраны клетки хозяина. Вирус гриппа — пример спирального вириона с оболочкой в виде правильного многогранника. Его геном составляют восемь разных фрагментов одноцепочечной РНК.
Две одинаковые одноцепочечные молекулы РНК внутри белкового капсида содержат некоторые онкогенные (опухолеродные) вирусы. Они имеют еще и внешнюю оболочку, состоящую из двойного липидного слоя плазматической мембраны клетки-хозяина, а также белков и гликопротеинов вирусного происхождения. Такое же строение имеет вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вызывающий синдром приобретенного иммунного дефицита (СПИД). Из онкогенных вирусов первым был открыт вирус саркомы Рауса, вызывающий злокачественные опухоли у кур. Изучение механизма трансформации клетки, т. е. превращения из нормальной в раковую, привело в 1970 г. американских ученых Г. Темина и Д. Балтимора к открытию явления обратной транскрипции. Вирус саркомы Рауса содержит фермент, называемый обратной транскриптазой. Этот фермент осуществляет синтез двуцепочечной ДНК, используя в качестве матрицы одноцепочечную вирусную РНК. Образовавшаяся молекула ДНК может встроиться в хромосому клетки-хозяина. Такой процесс встраивания в хромосомную ДНК называют интеграцией. Вирусный геном в форме интегрированной ДНК, синтезированной по проникшей в клетку вирусной РНК с помощью обратной транскриптазы, называют провирусом. Провирус становится частью генетического материала клетки, реплицируется вместе с клеточной ДНК и при делении передается дочерним клеткам. В скрытой форме провирус может пребывать бесконечно долгое время, переходя от родителей к потомкам через сперматозоид или яйцеклетку. Канцерогенные, т. е. приводящие к раку, факторы, такие, как рентгеновские лучи, табачный дым, асбестовая пыль, некоторые продукты переработки нефти, бензол и др., могут активировать провирус в отдельных клетках. В них образуются вирусные РНК и белки, происходит злокачественная трансформация.
РНК-содержащие вирусы, являющиеся первопричиной злокачественной трансформации, называют онкогенными ретровирусами (от лат. «ретро» — обратно, назад), потому что обратная транскрипция является необходимым этапом в их размножении. К ретровирусам относят и возбудитель СПИДа. Он внедряется в центральные клетки иммунной системы Т-лимфоциты, так как на их поверхности есть рецепторы, способные связываться с белками внешней оболочки ВИЧ. Иммунная система человека утрачивает свои защитные свойства и оказывается не в состоянии противостоять возбудителям различных болезней. ВИЧ передается при половом контакте, через зараженную кровь (совместное пользование загрязненными иглами для введения наркотиков, переливание непроверенной крови, случайный контакт медицинских работников с кровью больного), от матери к плоду во время беременности или новорожденному при родах. Средняя продолжительность жизни инфицированного человека составляет 7—10 лет.
При нормальной транскрипции вирусной ДНК, интегрированной в хромосому клетки, могут транскрибироваться и расположенные рядом гены самой клетки. После обратной транскрипции вирусной РНК эти гены могут встраиваться в хромосомы другого организма и оказываться в необычном для них окружении. Тем самым ретровирусы могут не только привносить в организмы дополнительную генетическую информацию, но и изменять работу генов хозяина. Ретровирусы могут переносить гены между клетками одного организма, между организмами как одного, так и разных видов или классов, когда половая гибридизация исключена. Сегодня вирусы рассматривают не только как возбудителей инфекционных болезней, но и как переносчиков генетической информации между видами. Кроме того, сам факт попадания вируса в живую клетку и перестраивание ее биохимических конвейеров на создание вирусного потомства если и не убивает клетку, то не проходит для нее бесследно. Разрывы хромосом, изменения в порядке расположения генов, а также изменения в самих генах остаются в «генетической памяти» клеток, посещенных незваными пришельцами.
- Чем определяется разнообразие форм вирионов?
- Какое влияние оказывают вирусы на организмы, в которых они паразитируют?
Источник
Ученые получили трансгенные растения, в хлоропластах которых образуется двухцепочечная РНК, нарушающая работу жизненно важного гена колорадского жука — гена белка цитоскелета β-актина. Все личинки жуков, которые в эксперименте питались листьями таких растений, погибали в течение пяти дней. В то же время разработанный подход высокоселективен в отношении вредителя и безопасен для опылителей.
XXI век — это век биотехнологий: развиваются методы адресной доставки лекарств в определенные органы или клетки с минимальным количеством побочных эффектов [1], становится возможным контролировать активность отдельных генов в разных тканях организма. Но при этом в сельском хозяйстве по-прежнему используются на удивление грубые методы — к примеру, применение инсектицидов, действующих абсолютно не избирательно и причиняющих вред не только поедающим растения насекомым-вредителям.
Каким же образом возможно точечно воздействовать на одних лишь вредителей? Все виды живых существ отличаются друг от друга своей ДНК, поэтому делать ДНК-ориентированную систему защиты от с/х-вредителей — это первое, что приходит на ум. Механизм можно позаимствовать у природы — во всех клетках эукариот существует система уничтожения подозрительных нуклеиновых кислот, которая используется для защиты от вирусов.
Дело в том, что только у вирусов бывают нуклеиновые кислоты особой структуры — двухцепочечные РНК (дцРНК). У всех остальных организмов молекулы РНК представлены в виде одиночных цепочек нуклеотидов. Обнаружив двухцепочечную РНК, клетка активирует механизм защиты под названием РНК-интерференция [2]. Специальные белки (Dicer) режут подозрительную молекулу РНК на фрагменты. Антисмысловые цепи этих фрагментов раздаются другим белкам (RISK), как фотороботы сотрудникам правоохранительных органов. Когда эти белки находят РНК или ДНК с похожей последовательностью (неважно, одноцепочечные или двухцепочечные), они ее уничтожают. А поскольку РНК — это единственный способ для гена проявить свою активность, получается, что гены, которым соответствовала двухцепочечная РНК, перестают работать.
Такой системой можно манипулировать: например, заставить клетку отключать собственные гены, «скормив» ей искусственно синтезированную двухцепочечную РНК с соответствующей последовательностью. Организм будет считать, что защищается от вирусов, и сам же отключит собственные гены. Если эти гены будут жизненно важными — организм погибнет.
Именно такую систему защиты от вредителей пытались реализовать в последние годы биотехнологи, создавая трансгенные растения вопреки предубеждению части общества относительно ГМО [3]. Они получали растения, в тканях которых синтезировались дцРНК с фрагментами генов колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata). Если насекомое ело трансгенное растение, двухцепочечная РНК с последовательностью одного из важных генов попадала в его клетки. Запускался механизм РНК-интерференции, и жук погибал.
К сожалению, эта система работала не так эффективно, и колорадские жуки после поедания трансгенных растений гибли не всегда. Проблема заключалась в том, что дцРНК синтезировалась в ядре растительной клетки, а затем попадала в цитоплазму, где встречалась с белком Dicer и разрезалась на фрагменты (рис. 1, справа). Когда насекомые ели растения с заранее нарезанной на короткие фрагменты РНК, ответ их клеток оказывался слабым [4]. Во-первых, короткие двухцепочечные РНК, как показано на примере некоторых насекомых, могут хуже поглощаться клетками. Во-вторых, существует вероятность, что нарезанные «чужими» для насекомых белками фрагменты РНК вызывают слабую реакцию клетки. Необходимо было найти способ сохранять длинную дцРНК в клетках растений до попадания в пищеварительную систему жуков. И такой способ был предложен: решили перенести синтез дцРНК из ядра клетки в хлоропласты, где нет белка Dicer [5].
Как известно, хлоропласты произошли от цианобактерий, которые поселились внутри клеток эукариот, дав им возможность фотосинтезировать. У бактерий нет системы классической РНК-интерференции, потому и у хлоропластов ее тоже нет. Поэтому двухцепочечную РНК решено было производить именно в хлоропластах, чтобы она дошла до насекомых-вредителей в неразрезанном виде (рис. 1, слева). Кроме того, локализация дцРНК в хлоропластах практически исключает возможность её появления в клетках цветов, а следовательно, и нанесения вреда насекомым-опылителям.
Рисунок 1. Схема защиты трансгенных растений от колорадского жука. Специфичность обеспечивается благодаря образованию в растении двухцепочечных РНК, соответствующих фрагменту жизненно важного гена определенного вредителя. Длинная дцРНК при попадании в клетку вызывает отключение соответствующего гена. Справа — двухцепочечная РНК синтезируется в ядре растительной клетки и режется на кусочки еще в самом растении. Такая короткая дцРНК не вызывает гибели существенного количества вредителей. Слева — ДНК, кодирующая двухцепочечную РНК, встроена в геном хлоропластов, и в этом случае РНК, оставшись невредимой, вызывает сильный ответ в клетках жуков, что приводит к их гибели. Рисунок из [4].
Чтобы РНК образовывалась в клетках в двухцепочечном виде, синтезировали фрагменты ДНК, кодирующие обе цепи — смысловую и антисмысловую. Эти фрагменты встраивались в ДНК хлоропластов благодаря последовательностям нуклеотидов, гомологичным определённым последовательностям в хромосомах пластид. После синтеза двух молекул одноцепочечной РНК они налипали друг на друга и образовывали дцРНК.
Рисунок 2. Листья «дикого» (слева) и трансгенного (справа) картофеля (в хлоропластах которого образуется двухцепочечная РНК для блокировки гена АСТ колорадского жука) каждый день давали личинкам. Фотография сделана на третий день эксперимента, и видно, что личинки колорадского жука почти не едят листья трансгенного картофеля. Рисунок из [5].
ДНК-матрицу доставляли в хлоропласты, обстреливая листья растений крошечными золотыми «пулями», облепленными ее молекулами. После этого из листьев получали культуру клеток (каллус), из которой отбирали клетки, чьи хлоропласты содержали привнесенную ДНК. А из подходящих клеток выращивали целые растения (растение иногда удается восстановить из отдельных его фрагментов: возможно, вы пробовали проращивать, к примеру, стебли роз, из которых можно получить полноценное растение).
В эксперименте с трансгенным картофелем использовали дцРНК для двух генов колорадского жука: ACT, кодирующего β-актин (белок цитоскелета), и SHR, кодирующего субъединицу белкового комплекса, вовлеченного в мембранную перестройку при транспорте везикул [5]. Двухцепочечная РНК, как и было задумано, синтезировалась в хлоропластах и сохраняла длину до попадания в организм колорадских жуков. Оказалось, что наиболее эффективна в деле борьбы с вредителями дцРНК для гена АСТ: когда листьями такого картофеля кормили личинок колорадского жука, все они погибали уже в течение трёх дней. Анализ подтвердил, что у личинок, которые питались листьями трансгенного картофеля, подавлялась экспрессия целевого гена. Листья трансгенного картофеля, в котором двухцепочечная РНК образовывалась в хлоропластах, были повреждены вредителями намного меньше, чем листья растений, у которых дцРНК синтезировалась в ядре, а также чем листья обычного картофеля (рис. 2).
Предложенный метод целенаправленной защиты растений от вредителей позволяет разработать различные варианты его применения. Например, последовательность нуклеотидов дцРНК можно подбирать таким образом, чтобы она действовала против нескольких видов насекомых, или производить в хлоропластах набор отдельных молекул двухцепочечной РНК для разных вредителей.
- Работа курьером, район — организм;
- Обо всех РНК на свете, больших и малых;
- Элементы: «ГМО — мифические опасности»;
- Whyard S. (2015). Insecticidal RNA, the long and short of it. Science. 347 (6225), 950–951;
- Zhang J., Khan S.A., Hasse C., Ruf S., Heckel D.G., Bock R. (2015). Full crop protection from an insect pest by expression of long double-stranded RNAs in plastids. Science. 347 (6225), 991–994..
Источник
