Цитоплазматические включения при оспе

1) размножение
вируса может сопровождаться гибелью
клеток или морфологическими изменениями
в них;

2) некоторые
вирусы вызывают слияние клеток и
образование многоядерного синцития;

3) клетки
могут расти, но делиться, в результате
чего образуются гигантские клетки;

4) в
клетках появляются включения (ядерные,
цитоплазматические, смешанные). Включения
могут окрашиваться в розовый цвет
(эозинофильные включения) или в голубой
(базофильные включения);

5) если
в культуре ткани размножаются вирусы,
имеющие гемагглютинины, то в процессе
размножения клетка приобретает
способность адсорбировать эритроциты
(гемадсорбция).

25) Природа телец включений и их диагностическое значение.

Вирусные
тельца-включения – образования, состоящие
или из скоплений вирусных частиц
(вирионов), или из клеточного материала.
Они встречаются при многих вирусных
инфекциях и представляют собой овальные
оксифильные тельца величиной1-10мкм,
периферически окруженные светлой зоной
– мантией. Их классифицируют по
локализации в клетке (внутриядерные,
цитоплазматические), составу нуклеиновой
кислоты (ДНК-, РНК-содержащие), тинкториальным
свойствам (базофильные, оксифильные),
гомогенности (аморфные, зернистые и
т.д.). Тельца включения локализуются
избирательно. При оспе всех видов
животных, в том числе птиц, бешенстве,
гриппе , парагриппе, чуме крупного
рогатого скота, пситтакозе и других
болезнях, как правило, развиваются
цитоплазматические тельца-включения;
при болезни Борна, ринотрахеите крупного
рогатого скота, ринопневмонии лошадей,
везикулярном стоматите, ларинготрахеите
птиц, аденовирусной инфекции и других
– ядерные.

С
помощью электронного микроскопа
установлена структура телец-включений
и выявлен ряд других, более тонких
морфологических изменений в инфицированных
клетках. Во многих случаях включения –
это места накопления или образования
вирусных частиц, например, тельца
Гварнирьери в цитоплазме клеток
зараженных вирусом осповакцины;
представляют собой фабрики вирионов,
а тельца Бабеша-Негри- скопления
нуклеокапсидов вируса бешенства.
Включения Каудри типа А формируются в
ядрах клеток, зараженных вирусом герпеса,
представляют собой глыбки маргинального
хроматина. Ядерные включения, встречающиеся
при аденовирусной инфекции, представляют
собой кристаллоподобные скопления
вирионов, или, что гораздо реже, — скопления
вирусных белков.

Цитоплазматические
тельца – включения развиваются при
болезнях, вызываемых сравнительно
крупными вирусами (оспа, бешенство).
Чаще они представленны в виде округлых,
овальных, или неправильной формы
образований. В пораженной клетке может
быть несколько телец – включений
различных размеров и форм. Обычно они
прилегают к ядру, отодвигая его к
периферии или окружая его, и обнаруживаются
в хорошо сохранившихся клетках. Для
каждого тельца-включения характерна
внутренняя структура. Так, тельца
Гварнирьери при оспе имеют вид рыхлых,
зернистых образований, при бешенстве
тельца Бабеша – Негри кажутся плотными,

Большинство
телец – включений содержит ДНК, что
является специфичным для ДНК – содержащих
вирусов. Хорошо изучены включения при
следующих вирусных болезнях животных:
оспе птиц (тельца Боллингера), бешенстве
(тельца Бабеша — Негри), болезни Борна
(тельца Дегена и Оста), чуме собак (тельца
Лектура), инфекционном ларинготрахеите
птиц (тельца Зейфрида), инфекционном
гепатите собак,

При
одной и той же болезни характер вирусных
включений различен, Так при кори
накопление цитоплазматических включений
кореллирует с накоплением вируса, а
внутриядерных – с реакцией клетки на
вирус.

Ядерные
включения встречаются при инфекциях,
вызываемых как относительно крупными
вирусами (герпес, болезнь Ауески, ИРТ,
ринопневмония лошадей и др.) так и
вирусами, имеющими очень мелкие размеры
(ящур, гепатит собак). Ядерные включения
лучше выявляются в гистологических
препаратах, морфологические детали
включений видны только при контрастной
окраске срезов; форма и размеры их
зависят от штаммовых особенностей
вируса, а также от методов гистологической
обработки материала. Различаютдва типа
внутриядерных включений: А и В. Включения
типа А – аморфные или округлой формы
оксифильные образования, четко
отграниченные от базофильной массы
ядра; нуклеоплазма находится в состоянии
глубокой деструкции; хроматин расположен
глыбками на деформированной оболочке
ядра. Включения типа А встречаются при
ринопневмонии лошадей, ИРТ КРС,
ларинготрахеите птиц, болезни Ауески.
Включения типа В имеют вид ацидофилных
гиалиновых зерен, нуклеоплазма
относительно мало изменена. Они
преимущественно при болезни Тешена,
Аденоинфекции.

При
ряде вирусных болезней обнаружение
телец – включений имеет диагностическое
значение. Многие из них настолько
патогномоничны, что обнаружение их,
стало основным из экспресс методов
диагностики бешенства, оспы, ринопневмонии
лошадей, аденовирусной инфекции и ИРТ
КРС. В диагностике гриппа животных,
болезни Ауески, ларинготрахеита птиц
и других болезней выявление телец
включений – вспомогательный метод. На
частоту выявления телец – включений,
кроме штаммовых различий влияет и
возраст животного (у молодых они
появляются с большим постоянством) и
физиологическое состояние организма.

Внуириклеточные
тельца включения при оспе разных видов
животных и птиы имеют много общего.
Неправильной овальной формы распологаются
в цитоплазме, обычно около ядра. Впервые
эти включения открыл в 1882 г. Д. Гварнирьери.
В 1896 г. Д. Боллингер обнаружил их при
оспе кур, а в 1903 г. Боррель при оспе овец.
Они обнаруживаются световой микроскопией
главным образом в пораженных участках
кожи. Причем в одних клетках они бывают
единичными, в других – множественными.
При окраске гематоксилин – эозином
включения обнаруживаются в виде овальных
образований величиной, примерно равной
величине ядрышка клетки. Центральная
их часть эозинофильна, с неровным
контурами. Каждое включение по периферии
окружено светлой зоной, мантией.

При
чуме собак цитоплазматические включения
впервые обнаружил Ленц в 1909 г. Они
встречаются в глиальных клетках
центральной нервной системы, а также в
в клетках самых разных органов и тканей.
Располагаются преимущественно в
цитоплазме клеток, оксифильны, имеют
овальную форму и различные размеры.

26)

Персистенция.
Некоторые вирусы могут переходить в
латентное состояние (так называемая
персистенция
для вирусов эукариот или лизогения
для бактериофагов — вирусов бактерий),
слабо вмешиваясь в процессы, происходящие
в клетке, и активироваться лишь при
определённых условиях. Так построена,
например, стратегия размножения некоторых
бактериофагов — до тех пор, пока
заражённая клетка находится в благоприятной
среде, фаг не убивает её, наследуется
дочерними клетками и нередко интегрируется
в клеточный геном. Однако при попадании
заражённой лизогенным фагом бактерии
в неблагоприятную среду, возбудитель
захватывает контроль над клеточными
процессами так, что клетка начинает
производить материалы, из которых
строятся новые фаги (так называемая
литическая
стадия).
Клетка превращается в фабрику, способную
производить многие тысячи фагов. Зрелые
частицы, выходя из клетки, разрывают
клеточную
мембрану,
тем самым убивая клетку. С персистенцией
вирусов (например, паповавирусов)
связаны некоторые онкологические
заболевания

27. Вирусологические
методы исследования —
методы изучения биологии вирусов и их
идентификации. В вирусологии широко
используются методы молекулярной
биологии, с помощью которых удалось
установить молекулярную структуру
вирусных частиц, способы проникновения
их в клетку и особенности репродукции
вирусов, первичной структуры вирусных
нуклеиновых кислот и белков. Развиваются
методы определения последовательности
составляющих элементов вирусных
нуклеиновых кислот и аминокислот белка.
Появляется возможность связать функции
нуклеиновых кислот и кодируемых ими
белков с последовательностью нуклеотидов
и установить причины внутриклеточных
процессов, играющих важную роль в
патогенезе вирусной инфекции.

Вирусологические
методы исследования основаны также на
иммунологических процессах (взаимодействие
антигена с антителами), биологических
свойствах вируса (способность к
гемагглютинации, гемолизу, ферментативная
активность), особенностях взаимодействия
вируса с клеткой-хозяином (характер
цитопатического эффекта, образование
внутриклеточных включений и т.д.).

В диагностике
вирусных инфекций, при культивировании,
выделении и идентификации вирусов, а
также при получении вакцинных препаратов
широко применяют метод культуры ткани
и клеток. Используют первичные, вторичные,
стабильные перевиваемые и диплоидные
клеточные культуры. Первичные культуры
получают при диспергировании ткани
протеолитическими ферментами (трипсином,
коллагеназой). Источником клеток могут
быть ткани и органы (чаще почки) эмбрионов
человека и животных. Суспензию клеток
в питательной среде помещают в так
называемые матрацы, бутыли или чашки
Петри, где после прикрепления к поверхности
сосуда клетки начинают размножаться.
Для заражения вирусами используют
обычно клеточный монослой. Питательную
жидкость сливают, вносят вирусную
суспензию в определенных разведениях
и после контакта с клетками добавляют
свежую питательную среду, обычно без
сыворотки.

Клетки большинства
первичных культур могут быть пересеяны,
такая культура называется вторичной.
При дальнейшем пассировании клеток
формируется популяция фибробластоподобных
клеток, способных к быстрому размножению,
большая часть которых сохраняет исходный
набор хромосом. Это так называемые
диплоидные клетки. При серийном
культивировании клеток получают
стабильные перевиваемые клеточные
культуры. При пассажах появляются быстро
делящиеся однородные клетки с
гетероплоидным набором хромосом.
Стабильные линии клеток могут быть
однослойными и суспензионными. Однослойные
культуры растут в виде сплошного слоя
на поверхности стекла, суспензионные
— в виде суспензий в различных сосудах
с использованием перемешивающих
устройств. Существует более 400 линий
клеток, полученных от 40 различных видов
животных (в т.ч. от приматов, птиц,
рептилий, амфибий, рыб, насекомых) и
человека.

В искусственных
питательных средах можно культивировать
кусочки отдельных органов и тканей
(органные культуры). Эти типы культур
сохраняют структуру ткани, что особенно
важно для выделения и пассирования
вирусов, которые не репродуцируются в
недифференцированных тканевых культурах
(например, коронавирусы).

В зараженных клеточных
культурах вирусы можно обнаружить по
изменению морфологии клеток, цитопатическому
действию, которое может иметь специфический
характер, появлению включений, путем
определения вирусных антигенов в клетке
и в культуральной жидкости; установления
биологических свойств вирусного
потомства в культуральной жидкости и
титрования вирусов в культуре ткани,
куриных эмбрионах или на чувствительных
животных; путем выявления отдельных
вирусных нуклеиновых кислот в клетках
методом молекулярной гибридизации или
скоплений нуклеиновых кислот цитохимическим
методом с помощью люминесцентной
микроскопии.

Для выделения вирусов
применяют заражение восприимчивых
лабораторных животных, куриных эмбрионов,
но чаще всего используют культуру ткани.
Наличие вируса обычно определяют по
специфической дегенерации клеток
(цитопатический эффект), образованию
симпластов и синцитиев, обнаружению
внутриклеточных включений, а также
специфического антигена, выявляемого
с помощью методов иммунофлюоресценции,
гемадсорбции, гемагглютинации (у
гемагглютинирующих вирусов) и т.д. Эти
признаки могут обнаруживаться лишь
после 2—3 пассажей вируса.

Для выделения ряда
вирусов, например вирусов гриппа,
используют куриные эмбрионы, для
выделения некоторых вирусов Коксаки и
ряда арбовирусов — новорожденных мышей.
Идентификацию выделенных вирусов
проводят с помощью серологических
реакций и других методов.

Лабораторная
диагностика вирусных инфекций включает
обнаружение возбудителя или его
компонентов в клиническом материале;
выделение вируса из этого материала;
серодиагностику. Выбор метода лабораторной
диагностики в каждом отдельном случае
зависит от характера заболевания,
периода болезни и возможностей
лаборатории. Современная диагностика
вирусных инфекций основана на
экспресс-методах, позволяющих получать
ответ через несколько часов после взятия
клинического материала в ранние сроки
после заболевания, К ним относятся
электронная и иммунная электронная
микроскопия, а также иммунофлюоресценция,
метод молекулярной гибридизации,
выявление антител класса lgM и др.

Электронная
микроскопия вирусов, окрашенных методом
негативного контрастирования, позволяет
дифференцировать вирусы и определять
их концентрацию. Применение электронной
микроскопии в диагностике вирусных
инфекций ограничивается теми случаями,
когда концентрация вирусных частиц в
клиническом материале достаточно
высокая (105 в 1 мл и выше). Недостатком
метода является невозможность отличать
вирусы, принадлежащие к одной
таксономической группе. Этот недостаток
устраняется путем использования иммунной
электронной микроскопии. Метод основан
на образовании иммунных комплексов при
добавлении специфической сыворотки к
вирусным частицам, при этом происходит
одновременная концентрация вирусных
частиц, позволяющая идентифицировать
их. Метод применяют также для выявления
антител. В целях экспресс-диагностики
проводят электронно-микроскопическое
исследование экстрактов тканей, фекалий,
жидкости из везикул, секретов из
носоглотки. Электронную микроскопию
широко используют для изучения морфогенеза
вируса, ее возможности расширяются при
применении меченых антител.

Метод молекулярной
гибридизации, основанный на выявлении
вирусоспецифических нуклеиновых кислот,
позволяет обнаружить единичные копии
генов и по степени чувствительности не
имеет себе равных. Реакция основана на
гибридизации комплементарных нитей
ДНК или РНК (зондов) и формировании
двунитчатых структур. Наиболее дешевым
зондом является клонированная
рекомбинантная ДНК. Зонд метят
радиоактивными предшественниками
(обычно радиоактивным фосфором).
Перспективно использование колориметрических
реакций. Существует несколько вариантов
молекулярной гибридизации: точечная,
блот-гибридизация, сэндвич-гибридизация,
гибридизация in situ и др.

Серологические
методы в вирусологии основаны на
классических иммунологических реакциях
(см. Иммунологические методы исследования):
реакции связывания комплемента,
торможения гемагглютинации, биологической
нейтрализации, иммунодиффузии, непрямой
гемагглютинации, радиального гемолиза,
иммунофлюоресценции, иммуноферментного,
радиоиммунного анализа. Разработаны
микрометоды многих реакций, техника их
непрерывно совершенствуются. Эти методы
используют для идентификации вирусов
с помощью набора известных сывороток
и для серодиагностики с целью определения
нарастания антител во второй сыворотке
по сравнению с первой (первую сыворотку
берут в первые дни после заболевания,
вторую — через 2—3 нед.). Диагностическое
значение имеет не менее чем четырехкратное
нарастание антител во второй сыворотке.
Если выявление антител класса lgM
свидетельствует о недавно перенесенной
инфекции, то антитела класса lgC сохраняются
в течение нескольких лет, а иногда и
пожизненно.

Для идентификации
индивидуальных антигенов вирусов и
антител к ним в сложных смесях без
предварительной очистки белков используют
иммуноблоттинг. Метод сочетает
фракционирование белков с помощью
электрофореза в полиакриламидном геле
с последующей иммуноиндикацией белков
иммуноферментным методом. Разделение
белков снижает требования к химической
чистоте антигена и позволяет выявлять
индивидуальные пары антиген — антитело.
Такая задача актуальна, например, при
серодиагностике ВИЧ-инфекции, где
ложноположительные реакции иммуноферментного
анализа обусловлены наличием антител
к клеточным антигенам, которые присутствуют
в результате недостаточной очистки
вирусных белков. Идентификация антител
в сыворотках больных к внутренним и
наружным вирусным антигенам позволяет
определять стадию заболевания, а при
анализе популяций — изменчивость
вирусных белков. Иммуноблоттинг при
ВИЧ-инфекции применяют как подтверждающий
тест для выявления индивидуальных
вирусных антигенов и антител к ним. При
анализе популяций метод используют для
определения изменчивости вирусных
белков. Большая ценность метода
заключается в возможности анализа
антигенов, синтезируемых с помощью
технологии рекомбинантных ДНК,
установлении их размеров и наличия
антигенных детерминант.

28.
Электронная микроскопия вирусов,
окрашенных методом негативного
контрастирования, позволяет дифференцировать
вирусы и определять их концентрацию.
Применение электронной микроскопии в
диагностике вирусных инфекций
ограничивается теми случаями, когда
концентрация вирусных частиц в клиническом
материале достаточно высокая (105 в 1 мл
и выше). Недостатком метода является
невозможность отличать вирусы,
принадлежащие к одной таксономической
группе. Этот недостаток устраняется
путем использования иммунной электронной
микроскопии. Метод основан на образовании
иммунных комплексов при добавлении
специфической сыворотки к вирусным
частицам, при этом происходит одновременная
концентрация вирусных частиц, позволяющая
идентифицировать их. Метод применяют
также для выявления антител. В целях
экспресс-диагностики проводят
электронно-микроскопическое исследование
экстрактов тканей, фекалий, жидкости
из везикул, секретов из носоглотки.
Электронную микроскопию широко используют
для изучения морфогенеза вируса, ее
возможности расширяются при применении
меченых антител.

29. ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ
ИССЛЕДОВАНИЯ-комплекс
методов исследования, позволяющих
распознать этиологию вирусного
заболевания и изучить его возбудителя.

Осн. этапами В. и.
являются выделение вируса от больных
и павших животных (взятие, консервирование,
пересылка и подготовка материала,
заражение им животных, куриных эмбрионов,
культуры клеток); титрование вирусов
для определения их кол-ва в исследуемых
материалах; культивирование вирусов
на восприимчивых домашних и лабораторных
животных, особенно на развивающихся
куриных эмбрионах и культурах тканей
(гл. обр. первичнотрипсинизированных).